饲料中的氨基酸 检测方法包

杭州乐冠国际科技有限公司

一. 仪器及试剂

仪 器：

1). 天平一台（精度0.1mg）；

2). 恒温水浴锅一台；

3). 容量瓶；

4). 试管（1.5×15cm或1.5×10cm）；

5). 微量进样器（5ul或10µl）一支；

6). 微量可调移液枪（1000ul）一支、吸头多个；

7). 旋涡混匀器一台；

8). HPLC系统及氨基酸分析柱（4.6×250mm）；

9). LC500梯度系统一台

试 剂：

1). 超纯水（≥18MΩ?cm）；

2). 乙腈（HPLC级）；

3). 三水合醋酸钠（分析纯）；

4). 冰醋酸（分析纯）；

5). 衍生试剂A和衍生试剂B溶液，至于冰箱保存（衍生试剂包对身体有害，用时请做好防护措施）；

6). 正己烷（HPLC级）。

二：样品制备

准确称取饲料10-50 mg，置于25 mL具塞比色管中，加1.0 mol/L盐酸10 mL，搅拌提取15 min，静置10分钟，将上清液过滤到100 mL容量瓶中，残渣加1.0 mol/L盐酸10 mL，搅拌3 min，重复提取两次，合并上清液，收集滤液并加1.0 mol/L盐酸定容至刻度，摇匀。

三. 流动相的配制

流动相A： 0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）：乙睛＝93：7

配制方法：准确称取三水合醋酸钠13.6g于1000ml水中，搅拌均匀，使之溶解，用冰醋酸或氢氧化钠溶液调pH值至6.5；准确量取配制好的三水合醋酸钠溶液465ml和乙腈35ml，混合均匀，抽滤过0.45µm滤膜； 

流动相B：水：乙腈＝20：80

配制方法：准确量取水100ml和乙腈400ml，混合均匀，抽滤过0.45µm滤膜；

四. 衍生化反应

1. 对照品溶液的制备

17种氨基酸对照品溶液用水稀释至原来浓度的1/10倍稀释作为对照品。

17种氨基酸对照品溶液稀释10倍后，各氨基酸的浓度为：

2. 供试品溶液制备

精密量取/称取供试品适量，并配制成相应浓度的溶液备用。

3. 衍生步骤

1）将恒温水浴锅预热至50±1℃；

2）分别将A、B两种衍生试剂用稀释剂稀释至原来浓度的1/5倍；

3）精密量取上述对照品溶液1ml，置于试管中，加入稀释后的A溶液0.5ml和稀释后的B溶液0.5ml，摇匀；在50±1℃水浴中加热45分钟，取出，加入正己烷溶液1ml，振摇；并用孔径为0.45μm有机膜过滤，放置30分钟后，取澄清的下层液进行分析试验；

4）供试品的衍生步骤与对照品相同；

五. 色谱条件

1. 色谱柱：Ultimate® AA，5μm，4.6×250mm；

2. 梯度程序：

流动相A： 0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）：乙睛＝93：7

流动相B： 水：乙腈＝20：80

T(min)                    A%                          B%

0.01                     100.0                      0.0

11                        93.0                      7.0

13.9                      88.0                       12.0

14                        85.0                       15.0   

29                        66.0                       34.0

32                        30.0                     70.0

35                         0.0                    100.0

42                         0.0                    100.0

45                       100.0                      0.0  

60                       100.0                      0.0

流　速：1.0ml/min

柱　温：40℃

 波  长：254nm

 进样量：5μl

 工作站记录时间：60min

色谱图：

六. 操作步骤和注意事项

1. 操作步骤：

1）设置柱温40℃和流速1.0ml/min；

2）将A、B两个通道用乙腈：水＝20：80排尽气泡（如B通道的原存留液中不含缓冲盐，则无需用乙腈：水＝20：80排气泡），B通道用流动相B再排尽气泡；

3）用乙腈：水＝20：80（A通道）冲洗系统20min，以防止缓冲盐析出；

4）A通道用流动相A排尽气泡，然后用流动相A走基线30min，平衡色谱柱；

5）运行一次空白梯度；

6）进样分析；

7) 分析完成后：

I）用乙腈：水＝20：80代替流动相A，进水样（清洗自动进样器），进行梯度洗脱；

II）换90％乙腈冲洗色谱柱40min以上；

2. 注意事项：

1）进样分析：先进对照品溶液，后进供试品溶液；

2）缓冲溶液，隔天需重新配制；

3）防止缓冲盐析出。

  氨基酸方法包，主要包括：